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荧光免疫分析原理图 时间分辨荧光免疫分析的分析原理

1, 时间分辨荧光免疫分析的分析原理



共有三个原理如下
时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。
分析原理
在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光,因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的,因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合,就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的,它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响,同时,荧光分析与普通分光不同,光电接受器与激发光不在同一直线上,激发光不能直接到达光电接受器,从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是,当进行超微量分析的时候,激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此,解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短,激发光消失,荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长,可达1~2ms,能够满足测量要求,因此而产生了时间分辨荧光分析法,即使用长效荧光标记物,在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。
平时常用的稀土金属主要是Eu(铕)和Tb(铽),Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定,但加入增强剂后可以克服;Tb荧光寿命1.6ms,水中稳定,但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解,因此从测量方法学上看Tb很好,但不适合用于生物分析,故Eu最为常用。
信号原理
普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱,在选择荧光物质作为标记物时,必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差,即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小,激发光谱和发射光谱常有重叠,相互干扰,影响检测结果的准确性。镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移,最大可达290nm,激发光谱和发射光谱间不会相互重叠,加上其发射的光谱信号峰很窄,荧光寿命长,铕的荧光寿命可达730us,检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式,待短寿命的背景荧光衰变消失后,再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光,可以避免本底荧光干扰,提高检测的精密度。
TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计,由三大部分组成:光源:脉冲光源:氙灯(每秒闪烁1000次);小型N2激光器;输出脉冲波长:337nm荧光信号获取系统;
增强原理
解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂,使其一端与铕(Eu)连接,另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接,形成EU标记的抗体/抗原,经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱,因此加入一种增强剂,使Eu从复合物上解离下来,自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团,这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光,信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤,因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。

2, 时间分辨荧光免疫分析法



时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是近十年发展起来的一测微量分析方法,是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19,较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。
时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的,它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响,同时,荧光分析与普通分光不同,光电接受器与激发光不在同一直线上,激发光不能直接到达光电接受器,从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是,当进行超微量分析的时候,激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此,解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短,激发光消失,荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长,可达1-2ms,能够满足测量要求,因此而产生了时间分辨荧光分析法,即使用长效荧光标记物,在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。
平时常用的稀土金属主要是Eu(铕)和Tb(铽),Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定,但加入增强剂后可以克服;Tb荧光寿命1.6ms,水中稳定,但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解,因此从测量方法学上看Tb很好,但不适合用于生物分析,故Eu最为常用。
由于常用Eu作为荧光标记,因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理:利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在,使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂,在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题,而使用了具有增强作用的新络合剂,因而有的试剂没有单独的增强剂。
随着检验医学的发展,对微量、超微量的测定会越来越多,同时RIA的污染问题会越来越被重视,因此,时间分辨荧光分析法(TRFIA)具有越来越大的应用空间。

名词解释


荧光

荧光(fluorescence)是一种光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出出射光(通常波长比入射光的的波长长,在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。一般以持续发光时间来分辨荧光或磷光,持续发光时间短于10-8秒的称为荧光,持续发光时间长于10-8秒的称为磷光。在日常生活中,人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光。

Eu

欧洲联盟(European Union,简称欧盟(EU))是欧洲多国共同建立的政治及经济联盟,总部设在比利时首都布鲁塞尔,该联盟拥有27个会员国(英国于2020年1月退出),正式官方语言有24种。 1952年,欧洲煤钢共同体建立,六年后,欧洲经济共同体和欧洲原子能共同体成立。1993年《马斯特里赫特条约》生效,欧共体转变成欧盟,渐渐地从贸易实体转变成经济和政治联盟。 2021年4月26日,欧盟委员会表示,已经对阿斯利康不遵守新冠疫苗供应合同,且没有可靠计划确保交付疫苗,对阿斯利康提起法律诉讼。

激发

激发(jī fā),汉语词语,意思是激动奋发。

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